fa کلونینگ و بیان اریتروپویتین نوترکیب انسانی در Leishmania tarentolae ژنتیک Genetic تحقيقي Original Articles زمینه و هدف : پروتئین اریتروپویتین انسانی هورمونی گلیکوزیله با وزن مولکولی 40 کیلو دالتون است که در کلیه سنتز شده و در تکثیر و تمایز اریتروسیت‌ها نقش دارد. این پروتئین دارویی با نام تجاری &laquo;اپویتین&raquo; شناخته شده و کاربرد موثری در درمان آنمی، سرطان و عفونت‌های ناشی از HIV ایفاء می‌کند. این مطالعه به منظور ارزیابی استفاده از میزبان انگلی لیشمانیا تارانتولا (Leishmania tarentolae) به منظور تولید فرم نوترکیب اریتروپویتین انجام شد. روش بررسی : در این مطالعه توصیفی ژن اریتروپویتین پس از بهینه‌سازی کدون توسط پایگاه‌های بیوانفورماتیکی سنتز شد و توسط استراتژی برش با آنزیم‌های KpnI و XbaI و خالص‌سازی از روی ژل در وکتور بیانی pLEXSY کلون گردید. سازه بیانی ساخته شده با روش الکتروپوریشن به لیشمانیا تارانتولا ترانسفکت شد. شناسایی و تایید کلونی‌های انگل ترانسفکت شده با سازه ژنی با استفاده از روش PCR با پرایمرهای تشخیصی سازه بیانی و پرایمرهای مخصوص اریتروپویتین انجام گرفت. ژن اریتروپویتین کلون شده توسط تتراسایکلین القاء گردید و بیان ژن در سوش‌های القاء شده با تکنیک SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ آنالیز شد. تعیین مقدار پروتئین نوترکیب تولید شده نیز با روش ELISA انجام شد. سازه بیانی اریتروپویتین برای کلونینگ و بیان در میزیان لیشمانیا تارانتولا توسط روش‌های مهندسی ژنتیک تایید شد. یافته‌ها : نتایج آنالیز بیان ژن در سوش انگل ترانسفکت شده توسط الکتروفورز SDS-PAGE و وسترن بلاتینگ تایید کننده ورود سازه ژنی به کروموزم انگل و بیان اریتروپویتین بودند. بهترین شرایط بیان پروتئین نوترکیب، 10 میکروگرم تتراسایکلین و زمان القاء 72 ساعت بود. وزن مولکولی پروتئین بیان شده 40 کیلو دالتون تخمین زده شد و میزان بیان آن نیز 12.4mg/l معادل با یک درصد کل پروتئین سلول تعیین گردید. نتیجه‌گیری : سازه بیانی برای کلونینگ و بیان ژن اریتروپویتین در لیشمانیا تارانتولا طراحی و ساخته شد و پروتئین مذکور با موفقیت القاء و شناسایی گردید. لیشمانیا تارانتولا می‌تواند به عنوان میزبان مناسب در تولید اریتروپویتین نوترکیب مورد استفاده قرار گیرد و این فناوری قابلیت بومی‌سازی نیز دارد. Background and Objective: Human erythropoietin (EPO) is a glycosylated hormone with molecular weight of about 40 KDa which is synthesized in kidneys and plays an important role in proliferation and differentiation of erythrocytes.This study was done to assess and analyze the expression of recombinant EPO in <i>Leishmania tarentolae</i> host. Method: In this descriptive study, the EPO gene was codoned , optimized with bioinformatics database prior to be synthesized. It was cleaved by KpnIandXbaI enzymes and cloned into pLEXSY expression vector. The constructed expression cassette was transfected into <i>Leishmania tarentolae</i> through electroporaton method. Identification and confirmation of transfected colonies was performed using PCR expression diagnostic primers and EPO specific primers. Induction of the cloned gene was done with tetracycline. The expression in induced strains was analyzed by SDS-PAGE and western blotting techniques. The amount of recombinant protein was quantified by ELISA method. Confirmation of cloning and EPO expression cassette was carried out through genetic engineering procedures. Results: Expression analysis of transfected parasitic strain with SDS-PAGE and western blotting confirmed gene integration into chromosomal of host as well as expression. The optimal conditions for expression were found to be 10&mu;g of tetracycline and 72h induction time. Molecular weight of expressed protein estimated to be 40 KDa and expression level was determined to be 12.4 mg/l which was equal to 1% of total protein mass. Conclusion: EPO expression cassette for cloning and expression in <i>Leishmania tarentolae</i> was designed and protein of interest was successfully induced and identified <i>Leishmania tarentolae</i> can be used as a suitable host for production of recombinant EPO and this technology has a potential for localization. اریتروپویتین , لیشمانیا تارانتولا , بیان ژن , کلونینگ Erythropoietin, Leishmania tarentolae, Gene expression, Cloning 86 93 http://goums.ac.ir/journal/browse.php?a_code=A-10-1-764&slc_lang=fa&sid=1 Kianmehr A انورسادات کیان مهر 5900319475328460050269 5900319475328460050269 No Ph.D Candidate in Medical Biotechnology, Pasteur Institute of Iran دانشجوی دکتری تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Shahbaz Mohammadi H حمید شهباز محمدی 5900319475328460050270 5900319475328460050270 No Ph.D Candidate in Medical Biotechnology, Pasteur Institute of Iran دانشجوی دکتری تخصصی بیوتکنولوژی پزشکی، انستیتو پاستور ایران Omidinia E اسکندر امیدی نیا eomid8@yahoo.com 5900319475328460050271 5900319475328460050271 Yes Associate Professor of Medical Biotechnology, Genetics and Metabolism Research Group, Pasteur Institute of Iran دانشیار گروه تحقیقات ژنتیک و متابولیسم، انستیتو پاستور ایران